A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
背景：目前为止正肆虐亚太地区的一新型冠状伤寒原伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和地区大广为流传，截至 2021 年 4 翌年已造成了有约 1.28 亿人传染，有约 280 所到之处死亡者。也就是说，尚无可适当提高 COVID-19 误杀率的疗法作法。我们学术研究了一种传统文化的中都药口服制剂——祛肺毒口服液 (RDS) 的潜在促冠状伤寒原活着性，该口服液主要化学成分为东方医学传统文化中都常用疗法肺脏伤寒症的中都泡茶。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 快伤寒原、SARS-CoV-2 快伤寒原、分离伤寒原性伤寒原-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型伤寒原以及传染性 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 var伤寒原 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶线粒体的传染。我们促使展示成 RDS 可以直接灭活着 SARS-CoV-2 伤寒原致密的传染性。此外，我们推测 RDS 还可堵塞伤寒原性伤寒原对靶线粒体的传染。
论证：RDS 可为广泛诱发肠胃伤寒原传染。标签：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状伤寒原，促伤寒原疗法，祛肺毒口服液，传统文化中都药，SARS-CoV，伤寒原性霍乱，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型伤寒原
▋背景
目前为止正肆虐亚太地区的一新型冠状伤寒原伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和地区大广为流传，截至 2021 年 4 翌年已造成了有约 1.28 亿人传染，有约 280 所到之处死亡者。也就是说，尚无可适当提高 COVID-19 误杀率的疗法作法。一新成现的 COVID-19 伤寒原致伤寒为冠状伤寒原 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急性呼出气综合征无关冠状伤寒原种类中都的姊妹伤寒原[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中都国推测的；SARS-CoV 伤寒原于 2002 年 11 翌年在广州市首次被推测[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 翌年在武汉首次被推测[1,7,8]。在中都国，这两次由冠状伤寒原引发的疫情中都，中都药皆被为广泛采用，用以紧急应对冠状伤寒原引发的伤寒症。对于也就是说的 COVID-19 大广为流传，中都国有有约 85% 的 SARS-CoV-2 传染伤寒患者给与了传统文化中都医药疗法（9，10）。许多采用的中都药是不是有着适当的促冠状伤寒原适应性并在针灸上是不是适当，这个极其重要问题都已得到充分致信。
中都药作为疗法冠状伤寒原所引来伤寒症的适当疗法，但由于考虑到体内或活体的系统学术研究，其拓展与合理采用皆受到了阻碍。为了确认中都药的潜在促 SARS-CoV-2 活着性，我们从常用中都药中都审核了多种泡茶苯七轮酸，并从中都药口服液 RDS(美国一种商业活动性蔬果本品) 中都推测了促 SARS-CoV 和促 SARS-CoV-2 伤寒原的活着性，一种在美国的商业活动蔬果本品。RDS 常用增强消化道性疾伤寒的总体身心健康，其包内含多种泡茶化学成分，如荞麦和婆罗门参，它们是传统文化上常用高度集中炎症和肺脏伤寒症的中都泡茶 (11-13)。在此，我们刊文 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假伤寒原以及有着传染性的野生型 SARS-CoV-2 伤寒原对靶线粒体的传染有着诱发起到。我们促使断定 RDS 可通过直接灭活着伤寒原致密或正当伤寒原侵入而诱发伤寒原的现代传染工程进度。此外，我们推测 RDS 还可以正当七轮流伤寒原对靶线粒体的传染。这些结果暗示，RDS 对肠胃伤寒原的传染也许有着为广泛的诱发起到。
▋结果
为了从传统文化中都泡茶中都找到潜在的促 SARS-CoV-2 活着性，我们从约四十种传统文化泡茶中都审核提取成 SARS-CoV-2S 肽假型快伤寒原[14,15] 和消化道肺脏 A549(ACE2) 靶线粒体，此本能 ACE2 基因会通过快伤寒原转导作为小分子内皮细胞，从而稳定转导来实现微表达成来。快假型伤寒原采用红色荧光肽 (GFP) 或荧光芝酶 (Luc) 作为刊文基因，并通过了有着广谱促伤寒原进到诱发剂，以及萨拉多尔 (Arbidol)[16]，和本能促毒血清对促 SARS-CoV-2(请注意 1a、C) 的验证。我们并能最终检查到萨拉多尔 (Arbidol) 和促毒血清对于 SARS-CoV-2 假型伤寒原的诱发起到，这是我们在其他四十余种传统文化泡茶苯七轮酸检验中都不能推测的，最主要其中都一些共存较高毒芝的泡茶 (请注意 1a-C)。然而，鉴于快性假型伤寒原极少能检查 SARS-CoV-2 伤寒原的侵入行为，我们无法除去这些泡茶苯七轮酸也许有在进到后阶段并能诱发 SARS-CoV-2 的先前。我们促使从传统文化用药祛肺毒口服液 (RDS) 中都审核成了也许的促 SARS-CoV-2 活着性，该电子产品内含可分泡茶化学成分——、黄连、荞麦、婆罗门参、天名精、苦杏仁、蜂房、皂角、生姜，在中都国传统文化上常用疗法肺脏伤寒症 (11-13)。
内含乙基果汁醇、3，4-二邻果汁酰基奎宁醇、乙基 3，4-二邻果汁酰基奎宁醇、原儿茶醇、乙基绿原醇和木犀草芝；小花中都还内含酰 A、B 和 10 种已确定环酰醚脂类酰[17]；该药用植物还内含皂甙甙 A 和 B，以及促炎症起到的酰 C[18,19]。黄连酯酰中都内含木脂芝、松脂醇和黄连酰[20]。荞麦中都内含被叫做荞麦皂酰的甾体皂酰，是荞麦旧称药用植物独有的药用植物化学物质[21,22]。小果婆罗门参中都主要活着性化学成分为四种单脂类，(−)-草莓酮、(+)-弗莱格酮、(−)-柠檬酰和 (+)-草莓噻唑；这种药用植物还内含其他衍有机体，如 1-辛酰-3-醇、3-辛酮、β-翌年桂酰和β-石竹酰[23]。天名精内含有约 162 种衍有机体，最主要环酰醚脂类和环酰醚脂类酰、苯丙酰、有机醇、脂类类、单糖、黄酮类、和皂酰[24]。苦杏仁中都内含酚类、乙烯衍有机体和果胶胶原蛋白[25]。皂角刺中都内含皂酰和羽扇豆醇[26,27]，而生姜中都内含主要活着性化学成分生姜醇[28]。为了促使检验 RDS 的促 SARS-CoV-2 活着性，用不同乙醇剂量的 RDS 处理程序 A549(ACE2) 线粒体，然后让这些线粒体在共存 RDS 的前提给与 4-6 同一短时间的传染。传染后，在不共存 RDS 的前提培育成线粒体，然后在 48 和 72 同一短时间的时候，通过流式线粒体练成对伤寒原传染的诱发起到同步进行取样。为了高度集中线粒体毒芝，采用氯化丙啶 (PI) 对紧接著死亡者和已死亡者的线粒体同步进行染色剂，极少在活着线粒体群中都系统性 GFP+线粒体。如请注意 2 请注意，我们判读到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假伤寒原有着mg反之亦然诱发起到。为了声称这些结果，我们采用内源性表达成来 ACE2 的 VeroE6 线粒体单调了该传染化验。
(见下页请注意)
ACE2 之下表达成来，反观 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 伤寒原可对其同步进行传染，ACE2 举例来说常用冠状伤寒原的学术研究 (7)。考虑到在考虑到 ACE2 微表达成来 [15，29，30] 的前提，假型伤寒原对 VeroE6 的传染性较少，我们还采用了荧光芝酶刊文基因假型伤寒原，该伤寒原的刊文基因表达成来由 HIV-1LTR 和 Tat 涡轮，有着更高的刊文基因敏感性和信噪比。
请注意 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型伤寒原传染 A549(ACE2) 线粒体。
A.A549(ACE2) 线粒体用 RDS 倒数乙醇 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型伤寒原传染。将线粒体彩衣去伤寒原和 RDS，并在不共存 RDS 的前提同步进行培育成。流式线粒体明为检查伤寒原传染诱发情况。未传染的线粒体和传染 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 疗法的线粒体作为对照。GFP+线粒体%-已暗示。(PI) 氯化丙啶。
B.RDS 的线粒体毒芝取样。A549(ACE2) 线粒体用 RDS 倒数乙醇 4 同一短时间，彩衣去 RDS，无 RDS 培育成 48 同一短时间。氯化丙啶染色剂鉴定将要死亡者线粒体和已死亡者线粒体，流式线粒体练成系统性。插图mg-反应线粒体毒芝双曲线，RDS 的半误杀剂量 (LC50) 比例为 1:11.9。
如请注意 3A 请注意，我们采用 Luc 报告基因假伤寒原和 VeroE6 线粒体同步进行传染化验，判读到 RDS 对该伤寒原传染有着mg反之亦然诱发起到，并且分之二诱发剂量确认为 1:230RDS 乙醇度 (请注意 3B)。我们还取样了 RDS 对 VeroE6 线粒体活着力的影响，确认了 50% 线粒体死亡者mg为 1:11.8RDS 乙醇度。
请注意 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假伤寒原和野生型 SARS-CoV-2 伤寒原的mg反之亦然诱发诱发起到。用 RDS 倒数乙醇处理程序 A、BVeroE6 线粒体，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型伤寒原传染。将线粒体彩衣去伤寒原和 RDS，并在不共存 RDS 的前提同步进行培育成。在传染后 72 同一短时间用荧光芝酶检查伤寒原传染的诱发起到。未传染线粒体和 SARS-CoV-2-luc 传染但未经过 RDS 疗法的线粒体作为对照。化验单调三次。插图mg反应双曲线和 RDS 的 I-C50 乙醇比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 线粒体的线粒体毒芝也通过氯化丙啶染色剂和流式线粒体练成取样。用 RDS 倒数乙醇 4 同一短时间，彩衣去 RDS，在不内含 RDS 的前提培育成 72 同一短时间。插图线粒体毒芝mg-反应双曲线，RDS 的半误杀剂量 (LC50) 比例为 1:13.8 乙醇。DRDS 诱发传染性 SARS-CoV-2 传染。用倒数乙醇的 RDS 处理程序 VeroE6 线粒体，并在 RDS 共存的前提传染 SARS-CoV-2。传染 48 同一短时间后，通过血菌斑系统性伤寒原被囚后的伤寒原复制诱发情况。诱发试制一式四份同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 中都采用单向皆取值 (One-Way ANOVA) 系统性及 Dunnett 后化验 (Dunnett's Post Test)，意在确认统计显着性。显著性取值用星号指出如下：*p
为了促使验证采用假伤寒原授予的结果，我们检验了 RDS 对于 SARS-CoV-2 传染的堵塞传染性并能。如请注意 3D 请注意，RDS 同时也堵塞了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 线粒体的传染。RDS 在乙醇 1:40 以上时可显著减少伤寒原斑点的演化成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假伤寒原与传染性伤寒原的结果暗示，RDS 内含诱发 SARS-CoV-2 传染的活着性化学成分，也许是通过直接灭活着伤寒原或堵塞伤寒原的现代传染工程进度。
为促使学术研究也许的的系统，我们将传染性 SARS-CoV-2 伤寒原致密与倒数乙醇的 RDS 在 37°C 下预培育成 1 同一短时间。随后，将组分促使依次乙醇-(10–1 至 10–4)，并沙入 Vero 线粒体同步进行血菌斑系统性以确认伤寒原传染性的提高。如请注意 4A 请注意，我们判读到在 RDS 中都一段时间掩盖一同一短时间后的伤寒原致密，其 SARS-CoV-2 的传染效价也排列成mg反之亦然攀升。该结果声称了 RDS 可适当直接灭活着 SARS-CoV-2 伤寒原致密的传染性。
我们促使检验了 RDS 是不是也能诱发 SARS-CoV-2 伤寒原var的传染。为此，我们依靠最近联合开发的分离七轮伤寒原-SARS-CoV-2 假型伤寒原 (Ha-CoV-2)[31] 来高纯度一系列 S 肽例外，最主要英国例外 (B.1.1.7)，南非例外 (B.1.351)，巴西例外 (P.1)，沙州例外 (B.1.429)，和其他几个一新兴例外 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和无关 S 肽反转体在 37°C 倒数乙醇 RDS 培育成 1 同一短时间。随后，用该组分传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶线粒体。传染后 12 同一短时间，荧光芝酶检测伤寒原传染的诱发起到。如请注意 4B 请注意，我们还判读到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 肽例外的mg反之亦然诱发。
我们还检验了 RDS 堵塞 SARS-CoV 传染的并能，采用带有 SARS-CoV 突刺肽的 GFP 刊文基因快伤寒原和[15] 伪mg。我们将人 A549(ACE2) 线粒体用作靶线粒体，将其用系列乙醇的 RDS 处理程序，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假伤寒原传染 4-6 同一短时间。传染后在不内含 RDS 的前提培育成线粒体，流式线粒体练成取样检查其对伤寒原传染的诱发起到。同样，采用氯化丙啶除去将要死亡者与已死亡者的线粒体，极少在活着线粒体群中都系统性 GFP+线粒体。如请注意 5A 请注意，我们判读到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型伤寒原的诱发起到排列成mg反之亦然。我们促使声称了这些结果，并取样了 RDS 内皮细胞的诱发与 Luc 刊文基因 SARS-CoV 假型伤寒原，SARSCoV(Luc)。我们判读到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱发起到排列成mg性依赖，其半诱发剂量 (IC50) 为 1:70.88 乙醇度 (请注意 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都采用 ACE2 传染靶线粒体，我们还检验了 RDS 的促伤寒原活着性是不是极少针对与 ACE2 有相互起到的冠状伤寒原。为此，我们检查了一种不无关的负链 RNA 伤寒原--伤寒原性伤寒原。它通过伤寒原血凝芝 (HA) 和线粒体α-唾液醇来传染靶线粒体。为了高纯度伤寒原性伤寒原，将表达成来伤寒原性霍乱 A/WSN/33(H1N1) 基因序列每个短片的 8 个小分子和一个 GFP-刊文基因共转染到 HEK293T 线粒体中都。在 RDS 共存的前提，收集伤寒原致密并常用传染目标 MDCK 线粒体。如请注意 6A 请注意，我们判读到 RDS 对伤寒原性伤寒原的诱发起到排列成mg反之亦然。RDS 在 1:40 和 1:80 乙醇时可无论如何堵塞伤寒原传染，在 1:160 乙醇亦同可部分诱发伤寒原性霍乱。RDS 对 MDCK 线粒体的半误杀剂量 (LC50) 经检测为 1:18.5(请注意 6B)。这些结果暗示，RDS 的促伤寒原活着性并非针对特定伤寒原，而也许并能为广泛诱发多种肠胃伤寒原，如冠状伤寒原和伤寒原性伤寒原。
▋探讨
在本报告中都，我们展示成传统文化用药祛肺毒口服液 (RDS) 内含广谱促伤寒原活着性，可堵塞 SARS-CoV、SARSCoV-2 和伤寒原性伤寒原的传染。虽然 RDS 并能诱发多种伤寒原，但其促伤寒原活着性因伤寒原类型和伤寒毒性而异。例如，对 SARS-CoV 快假伤寒原的 I-C50 剂量为 1:7.9 乙醇度，对 SARS-CoV-2 快假伤寒原的 I-C50 剂量为 1:230 乙醇度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 伤寒原，I-C50 为 1:40 乙醇度，对伤寒原性霍乱，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其var有不同的诱发起到，IC50 数取值从 1:70 到 1:2601 乙醇度约数 (请注意 4B)。
(见下一页请注意)
请注意 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 var有着mg反之亦然灭活着起到。ASARS-CoV-2 致密沙倒数乙醇的 RDS 在 37°C 下培育成 1 同一短时间。随后，将组分促使倒数乙醇，并沙入 Vero 线粒体中都同步进行血菌斑系统性，以确认伤寒原传染性提高。诱发试制一式四份同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 中都采用单向皆取值 (One-WayANOVA) 系统性和 Dunnett 后化验 (Dunnett'sPostTest) 意在确认统计显着性。显著性取值用星号指出如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和无关 S 肽例外与倒数乙醇的 RDS 在 37°C 培育成 1 同一短时间后，用组分传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶线粒体。传染后 12 同一短时间，荧光芝酶检测伤寒原传染的诱发起到。RDS 的 IC50 取值的乙醇度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们促使展示成 RDS 可以诱发冠状伤寒原的现代传染工程进度。虽然就其的促伤寒原的系统都已明确，但 RDS 可以通过直接灭活着伤寒原致密或通过正当伤寒原侵入或堵塞伤寒原侵入后的现代工程进度来正当伤寒原传染。在其他几种传统文化中都药中都也推测了促 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活着性。例如，一种常见的传统文化中都药——生姜。
生姜根中都已断定内含生姜醇芝，可诱发 SARS 伤寒原[32] 针灸分离株的复制。此外，另一种可常用疗法肠胃伤寒症的中都药——双黄连制剂，已暗示成在活体以mg反之亦然手段诱发 SARS-CoV-23CL 肽酶 (3CLpro) 活着性。冬青酰和冬青芝拟作为双黄连堵塞 3CLpro[33] 的适当化学成分。
请注意 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型伤寒原对 A549(ACE2) 线粒体的传染。用倒数乙醇的 RDS 处理程序 A、B 线粒体，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型伤寒原传染。将线粒体除去，去掉伤寒原和 RDS，在不共存 RDS 的前提同步进行培育成。在传染后 48 同一短时间和 72 同一短时间，通过流式线粒体练成或荧光芝酶检查来取样伤寒原传染的诱发起到。化验单调三次。插图mg组织起来双曲线，并插图 RDS 的 IC50 取值为 1:70.9 乙醇度 (C)
请注意 6 RDS 诱发七轮流伤寒原对 MDCK 线粒体的传染。(A) 用倒数乙醇的 RDS 处理程序 MDCK 线粒体 30 分钟，然后用七轮流伤寒原 (GFP) 对其同步进行传染。传染后，在 RDS 共存下培育成线粒体。36 同一短时间后用流式线粒体明为对伤寒原传染的诱发起到同步进行取样。把未传染的线粒体与被七轮流伤寒原 (GFP) 传染但未经 RDS 处理的线粒体同步进行对比。请注意中都暗示了 GFP+线粒体的%-。PI 指出氯化丙啶 PI。
(B) 另外还采用了 MTT 检测法取样了 RDS 对 MDCK 线粒体的毒芝，插图了线粒体毒芝的mg-反应双曲线，经计算，RDS 的分之二误杀剂量为 1:18.5 乙醇度 RDS 的适当促伤寒原化学成分都已确认。然而，RDS 不同于冬青酰和冬青芝，RDS 可以通过直接灭活着伤寒原光子来堵塞伤寒原传染 (请注意 4)，而冬青酰和冬青芝则在伤寒原一段时间内的后期通过堵塞伤寒原肽酶的活着性来意味著。然而，RDS 的活体促 SARS-CoV-2 活着性仍须在更进一步的动物学术研究和本能针灸试制中都得到声称。目前为止，我们将要同步进行小型动物化验，以确认 RDS 在体内堵塞 SARS-CoV-2 伤寒原传染的潜力。
▋论证
我们的学术研究暗示，RDS 可为广泛诱发肠胃伤寒原的传染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和伤寒原性霍乱。
▋作法
线粒体和线粒体培育成
HEK293T (ATCC 博拉奇克，乔治亚州) MDCK (ATCC 博拉奇克，乔治亚州)，VeroE6 (ATCC 博拉奇克，乔治亚州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠送给，博拉奇克，乔治亚州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠送给，博拉奇克，乔治亚州) 目前为止保留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 内含 10% 热灭活着 FBS 和 1×青霉芝-瓦克斯曼 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 线粒体培育成基中都分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的剂量沙入嘌呤霉芝和潮霉芝 B。
核醇转染和伤寒原高纯度
内含 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的快性假型伤寒原致密由 Virongy LLC (Manassas，VA) 缺少，或按照右边详细描述的作法[15] 高纯度。简言之，为了高纯度 GFP 刊文基因快性假伤寒原，HEK293T 线粒体与表达成来 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的小分子、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产成荧光芝酶刊文基因快性假型伤寒原，将 HEK293T 线粒体与表达成来 SARSCoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的小分子、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行共转染。转染后 48 同一短时间收集伤寒原上清液，离心浓缩，−80℃ 保留。野生型 SARS-CoV-2 伤寒原 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 缺少。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因核醇和 A/WSN/1933 H1N1 衍生核醇 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友好缺少。在伤寒原 A-GFP 刊文基因光子高纯度中都，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 线粒体 (ΔAT6)。48 同一短时间后收集伤寒原上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表达成来小分子购自 Sinobiological。依靠 Twist Bioscience 制备了 Ha-CoV-2(Luc) 小分子和 S 肽反转小分子。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽反转光子按照右边详细描述作法[31] 同步进行高纯度。
伤寒原传染和用药诱发试制
RDS(祛肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赠送给，利斯堡，乔治亚州) 是由牛博士化验室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业活动电子产品。RDS 中都所有中都泡茶化学成分皆相一致《中都国国家规范 2015 年版》「饮片」规范，最主要适当化学成分浓度及重金旧称、农药限量检查。RDS 是一种中都药的共煎剂，如此一来一产物在热力有条件下蒸发。SARS-CoV-2 促血清由 LanceA. Liotta 牙医缺少。将萨拉朵尔盐醇盐 (Sigma) 再度悬浮在二乙基亚砜 (Sigma) 中都。对于假型伤寒原传染，12 孔板中都的 A549(ACE2) 线粒体 (来自 Virongy LLC 赠送给，博拉奇克，乔治亚州) 或 VeroE6 线粒体用 RDS 处理程序 30 分钟，在 37℃ 下传染 4-6 同一短时间，然后在一新鲜培育成基中都干净培育成 48-72 同一短时间。对于 VeroE6 线粒体的传染，线粒体也被 CoV-2 假型伤寒原传染增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠送给，博拉奇克，乔治亚州) 处理程序后，在 37°C 下如此一来处理 30 分钟。采用 GloMaxDiscover 酶标明为 (Promega) 系统性线粒体裂解物的荧光芝酶活着性。对于野生型 SARS-CoV-2 传染，VeroE6 线粒体在 37°C 下用 RDS 处理程序 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 传染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华布洛克的学校的 BSL-3 犯人体育场馆内返程 1 同一短时间。线粒体用 PBS 干净 2 次，用内含 RDS 的培育成基培育成 48 同一短时间。从上清中都提取伤寒原，用 12 孔板培育成的 Vero 线粒体单层中都的血菌斑试制检测小瓶滴度。简言之，每个混合物在基本的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育成基 (VWR) 中都高纯度，包内含 1X 青霉芝-瓦克斯曼 (VWR)，并添沙 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种乙醇液出气附到 VeroE6 线粒体单层的三个两条线孔上 1 同一短时间。然后用 1～2 ml0.6% 长丝糖 (Invitrogen) 和一部分基本的 Eagle Minimal Essential 培育成基 (VWR) 的组分隔开单层，内含 1X 青霉芝-瓦克斯曼，并添沙 10%FBS。48 同一短时间后，将单层膜固定在 10% 七轮醛溶剂中都 1 同一短时间，并移除隔开的长丝塞。为了染色剂斑点，沙入内含 20% 乙醇的 1% 结晶紫染料溶剂 5 分钟，然后用去离子水干净。对于伤寒原性伤寒原传染 MDCK 线粒体，在 37°C 下用 RDS 处理程序 30 分钟，然后用 A-GFP 刊文基因伤寒原传染 6 同一短时间。用内含 RDS 的培育成基干净线粒体，培育成 36 同一短时间。GFP 表达成来通过流式线粒体明为取样。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 伤寒原致密的 RDS 灭活着试制，将 100μl 倒数乙醇的 RDS 添沙到 1 mlSARS-CoV-2 伤寒原原液 (3.65×105PFU/ml) 中都，如此一来一 RDS 乙醇为 1:20，1:40 或 1:80。也最主要对照有条件 (1 ml 伤寒原+100μl 培育成基)。组分在 37°C 下培育成 1 同一短时间。随后，对组分同步进行系列乙醇以造成了额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 乙醇度，并将倒数乙醇的混合物沙入 12 孔板中都的 Vero 线粒体中都，常用同步进行血菌斑检测系统性。斑点检测中都如此一来一的 RDS 乙醇度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 乙醇液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽反转光子按照右边详细描述的作法[31] 高纯度。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活着，将 5μl 倒数乙醇的 RDS 添沙到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或例外中都，如此一来一 RDS 乙醇度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将组分在 37°C 下培育成 1 同一短时间，然后在 RDS 共存下传染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 线粒体 12 同一短时间。采用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 系统性线粒体裂解物的荧光芝酶活着性。
线粒体毒芝系统性检查
用氯化丙啶染色剂和流式线粒体练成取样对 A549 (ACE2) 线粒体和 VeroE6 线粒体的用药线粒体毒芝同步进行检查，如详细描述 (34)。采用线粒体增殖盐酸盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商要求的可行性对 MDCK 线粒体的用药毒芝同步进行取样。简言之，将 MDCK 线粒体 (ATCC) 以每孔 1×-105 个线粒体的低速接种到 12 孔板中都。线粒体培育成隔夜后，通过 RDS 处理 1 天，然后在 MTT 记号盐酸 (Sigma) 的培育成基中都培育成。将线粒体与记号盐酸主导培育成 4 同一短时间，如此一来后续沙入 MTT 增溶剂。培育成皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 检测出气光度。
简称
SARS-CoV：严重急性性疾伤寒综合征无关冠状伤寒原；SARSCoV-2：Severe 严重急性性疾伤寒综合征无关冠状伤寒原-2；TCM：传统文化中都药；RDS：肠胃瘦身口服液；Ha-CoV-2：分离伤寒原性一新冠伤寒原假伤寒原。
致谢
致谢 FengLi 缺少伤寒原表达成来小分子，致谢 LanceLiotta 缺少促毒血清；致谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的探讨与要求；致谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 缺少 RDS 和泡茶苯七轮酸。
作者贡献
此次化验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 刊载，由 L.A.H. 总编。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该化验。所有作者已写出并批准如此一来一文稿。
银行贷款
本学术研究的经费来自于爱德华布洛克的学校之下拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 缺少。
统计数据和材料的复杂性
本学术研究中都造成了或系统性的所有统计数据皆包内含在本文中都。盐酸可从 Y.W 处获取。
单方面
批准及参与达成协议
不仅限于
达成协议成版
不仅限于
竞争利益
爱德华布洛克的学校国家政府有机体牵制和黄热伤寒中都心的 RMH 和 YW 已授予了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的学术研究资助，LAH 为德佳和畅身兼助理并授予了酬金。不能其他彼此间或活着动但会影响到提交的文书工作。
作者清单
1美国乔治亚州爱德华布洛克的学校计算机科学学院国家政府有机体牵制和黄热伤寒中都心，博拉奇克 20110。
2VirongyLLC，乔治亚州博拉奇克。3沙拿大伯纳比，BCV5J0E5 牛博士化验室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 美国乔治亚州利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿日期：2021 年 4 翌年 7 日
给与日期：2021 年 5 翌年 10 日
线上成版短时间：2021 年 5 翌年 29 日
参考文献
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
总编： 翟微男相关新闻
相关问答
